CHUỖI BÀI VIẾT KỸ THUẬT VỀ NGHIÊN CỨU PROTEIN TẬP 1
Tập 3: Kỹ thuật chuyển màng
WESTERN BLOT – NHỮNG ĐIỀU CÓ THỂ BẠN CHƯA BIẾT!
Quy trình chuẩn bị mẫu trong kỹ thuật Western Blot
Kỹ thuật Western Blot là một kỹ thuật trong quan trọng sinh học phân tử và nghiên cứu tế bào. Thông qua phương pháp này, các nhà nghiên cứu có thể phát hiện các protein đặc hiệu từ một hỗn hợp protein tách ra từ tế bào. Kỹ thuật này sử dụng ba yếu tố chính:
1. Phân tách theo kích thước
2. Chuyển lên màng
3. Đánh dấu protein đích sử dụng kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp tương thích để hình ảnh hóa băng protein
Hình ảnh tổng quan quy trình western blot:
Trong bài viết này, chúng tôi xin giới thiệu một số quy trình chuẩn bị mẫu cho kỹ thuật Western Blot, bao gồm phá tế bào và tách chiết protein từ các nền mẫu khác nhau. Đây là bước khá quan trọng trong toàn bộ quy trình để đảm bảo tách chiết được protein đích với hoạt tính không đổi cho các ứng dụng tiếp theo.
Tất cả các bước tách chiết protein từ tế bào hoặc mô đều phải được thực hiện trong điều kiện lạnh (2-8oC).
Một số hóa chất tham khảo cho bước tách chiết protein
• RIPA buffer for protein extraction ready-to-use-solution(Product No. R0278)
• Triton X-100 (T8787) 1%
• Sodium deoxycholate (D6750) 0.5%
Ngoài ra, hãy sử dụng chất ức chế proteinase để bảo vệ protein khỏi bị phân hủy bởi các enzyme proteinase. Merck cung cấp danh mục đầy đủ, phổ rộng từng chất ức chế protease riêng biệt và hỗn hợp cocktail chất ức chế protease, đã được tối ưu hóa để giữ và bảo vệ chức năng của protein trong quá trình ly giải tế bào.
Các bước tách chiết protein:
• Loại bỏ môi trường trong đĩa nuôi cấy tế bào và rửa tế bào sử dụng PBS lạnh sâu
• Loại bỏ PBS, thêm đệm ly giải lạnh sâu
• Cạo thu tế bào sử dụng dụng cụ cào tế bào lạnh và chuyển tế bào sang ống eppendorf
• Lắc đều các thành phần trong ống trong khoảng 30 phút, 4oC
• Ly tâm các ống ở 16.000G trong 20 phút, 4o Thu dịch nổi sang ống mới và đặt trong đá. Loại bỏ cặn đáy.
Tách chiết protein từ tế bào nổi:
• Ly tâm dịch nổi chứa tế bào ở 2000G trong 5-7 phút, 4o Thu các tế bào dưới đáy ống, loại bỏ dịch nổi
• Với cặn tế bào, thêm PBS lạnh sâu và rửa tế bào bằng ly tâm ở 2000G trong 5-7 phút, 4oC
• Thêm đệm ly giải lạnh sâu. Lắc đều các thành phần trong ống khoảng 30 phút, 4oC
• Ly tâm các ống ở 16.000G trong 20 phút, 4o Thu dịch nổi sang ống mới và đặt trong đá. Loại bỏ cặn đáy
Tách chiết protein từ mẫu mô:
• Cắt tách phần mô quan tâm trên đá. Chuyển mô sang các ống eppendorf đáy tròn và cấp đông nhanh bằng cách nhúng vào dung dịch nito lỏng
• Với 5mg mô, thêm 300uL đệm ly giải lạnh sâu và nghiền sử dụng máy nghiền đồng nhất. Thêm tiếp 300-600uL đệm ly giải trong quá trình nghiền mẫu
• Lắc đều các thành phần trong 2 tiếng, 4oC
• Ly tâm các ống ở 16.000G trong 20 phút, 4o Thu dịch nổi sang ống mới và đặt trong đá. Loại bỏ cặn đáy
Đồng đều lượng protein tổng số ở các mẫu
• Lấy một lượng nhỏ dịch ly giải để thực hiện đo lượng protein
• Định lượng protein có thể được thực hiện, sử dụng Coomassie protein assay reagent (mã sản phẩm tham khảo 27813), BCA, hấp phụ ở bước sóng 280nm
• Xác định nồng độ protein trong mẫu chưa biết bằng cách so sánh với chuẩn, đảm bảo mẫu chuẩn cũng được pha loãng với cùng loại đệm như mẫu chưa biết
• Chuyển lượng dịch ly giải phù hợp sang ống eppendorf để tất cả các mẫu sẽ chứa cùng một nồng độ protein tổng số
• Thêm đệm ly giải lạnh sâu để đảm bảo các dịch ly giải sẽ có cùng thể tích
Trộn mẫu với đệm nạp mẫu laemli:
Chuẩn bị những thành phần sau trong đệm nạp mẫu để chạy điện di
• 2X Laemmli loading buffer
• Bromophenol blue(Product No. B5525) 0.004%
• 2-mercaptoethanol 10%
• Glycerol(Product No. G5516) 20%
• Tris-HCl(Product No. T1503) 0.125 M
– Thêm lượng đệm nạp mẫu bằng với thể tích dịch ly giải
– Đun nóng mẫu ở 95oC, trong 5 phút. Ly tâm 16000G trong 5 phút
– Những mẫu này có thể bảo quản ở -20oC hoặc thực hiện nạp ngay lên gel điện di.
Tham khảo toàn bộ danh mục sản phẩm toàn diện cho kỹ thuật Western Blot tại đây.
Trong tập 2, chúng tôi sẽ giới thiệu các quy trình trong bước Điện di SDS-PAGE. Hãy cùng theo dõi để cập nhật thêm các thông tin về kỹ thuật Western Blot.
Liên hệ chúng tôi để được tư vấn.
