Kỹ thuật Chuyển màng – Chuối bài viết về nghiên cứu Protein – Tập 3

Kỹ thuật chuyển màng

Chúng ta hãy cùng nhau xem protein từ bản gel được chuyển lên màng cần lưu ý những gì nhé

Tập 1: Quy trình chuẩn bị mẫu trong kỹ thuật Western Blotting

Tập 2: Quy trình phân tách Protein trên bản Gel SDS-PAGE

Tập 3: Kỹ thuật chuyển màng

Tập 4: Phương pháp phát hiện miễn dịch

Tập 5: Western Blotting và giải pháp xử lý sự cố

Nguyên vật liệu cần chuẩn bị cho kỹ thuật chuyển màng:

• Blotting paper

• Màng chuyển (vd. Immobilon® PVDF)

• Transfer buffer

• Methanol, Ethanol hoặc Isopropanol

• Hệ thống buồng chuyển (vd, SB10 omniPAGE mini electroblotting system)

• Nguồn điện

Chuẩn bị thực hiện kỹ thuật chuyển màng

1. Chuẩn bị đủ đệm chuyển màng để đổ ngập buồng chuyển, và thêm 200 mL để ổn định gel và màng, và làm ướt giấy lọc.

2. Tháo gel ra khỏi cassette; cắt bỏ phần tacking gel và các giếng.

3. Nhúng gel vào dung dịch đệm chuyển từ 10 tới 30 phút.

4. Ngâm giấy lọc trong dung dịch đệm chuyển ít nhất 30 giây.

5. Chuẩn bị màng:

• a. Nếu sử dụng màng PVDF, làm ướt màng trong methanol khoảng 15 giây. Màng phải chuyển đồng đều từ mờ đục sang nửa trong suốt.
• b. Cẩn thận đặt màng trong nước Milli-Q® và ngâm khoảng 2 phút.
• c. Cẩn thận đặt màng vào dung dịch đệm chuyển và để ổn định trong ít nhất 5 phút.

Thao tác chuyển màng

1. Mở phần giữ cassette.
Chú ý: Để đảm bảo chuyển đều, loại bóng khí giữa các lớp bằng con lăn Blot Roller hoặc cẩn thận lăn pipette hoặc que khuấy trên bề mặt mỗi lớp khi xếp. Không tạo áp lực quá mạnh để tránh làm hỏng màng và gel

2. Đặt một miếng xốp bọt biển lên một mặt của cassette.

3. Đặt một tấm giấy lọc lên trên miếng xốp.

4. Đặt miếng gel lên trên giấy lọc.

5. Đặt màng lên trên bản gel.

6. Đặt tấm giấy lọc thứ hai lên trên.

7. Đặt miếng xốp bọt biển thứ hai lên trên giấy lọc.

8. Đóng khung giữ cassette.

Phương pháp chuyển protein (Buồng chuyển)

1. Đặt giá cassette vào buồng chuyển, để mặt có gel ở cực âm (-) và phía có màng thì ở cực dương (+).

2. Thêm đệm vào buồng chuyển ngập hết giá cassette.

3. Lắp cực màu đen (–) và cực màu đỏ (+) với giắc cắm tương ứng trong buồng chuyển

4. Cắm cực dương và cực âm tương ứng với lỗ cắm trên nguồn điện.

5. Đặt 1 cục gel lạnh trong buồng chuyển theo hướng dẫn của nhà sản xuất

6. Bật hệ thống chạy từ 1-2 tiếng ở 6 – 8 V/cm khoảng cách giữa các điện cực. Thực hiện theo đúng hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

7. Sau khi hoành thành chuyển, tháo cassette ra khỏi buồng.

8. Dùng forceps, cẩn thận tách các lớp ra khỏi khung.

Những mẹo giúp chuyển màng thành công!

• • Trong cả 2 hệ thống chuyển (chuyển ướt và bán khô), lưu ý tránh tạo bong bóng giữa giấy lọc, màng và gel.
• • Chuyển protein với dòng điện ổn định. Với dòng điện ổn định, kiểm tra đảm bảo cường độ không quá 0.4 amp. Bắt đầu từ 100 V và giảm điện thế nếu cường độ dòng điện quá cao.
• • Gel dày hoặc protein kích thước lớn có thể đòi hỏi thời gian chuyển màng lâu hơn Điều kiện chuyển màng thực tế cần được tối ưu hóa cho mỗi hệ thống.
• • 2 mặt của màng chuyển Immobilon® đều hoạt động như nhau. Mặt bóng hay trơ đều không ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển màng và phát hiện.
• • Với mẫu chứa protein kích thước nhỏ, cân bằng gel trong đệm chuyển không nên quá 10 phút.
• • Sử dụng Immobilon® PSQ để thu được tối đa các protein có kích thước 20kDa hoặc nhỏ hơn.
• • Sử dụng màng Immobilon®-FL cho phương pháp phát hiện huỳnh quang.
• • Gels có thể được chuyển đơn hoặc nhiều bản cùng lúc trong 1 giá đỡ.

Sau khi protein được chuyển từ gel lên màng, bạn có thể yên tâm chúng ta đã đi được hơn nửa đường của quy trình western blotting rồi. Ở bài viết sau, chúng ta sẽ tiến tới những công đoạn cuối cùng để phát hiện protein trên màng nhé. Hãy cùng theo dõi để cập nhật thêm các thông tin về kỹ thuật Western Blot.

Các bạn có thể tham khảo thêm sản phẩm tại đây: https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/protocol/protein-biology/gel-electrophoresis/sds-page

Tải Brochure tại đây

Chúc các bạn thành công với kỹ thuật chuyển màng nhé!