THÔNG TIN KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG VI SINH

Môi trường nuôi cấy dạng hạt TBX: Chromocult TBX (Tryptone Bile X-glucuronide) Agar

Theo tiêu chuẩn. ISO 16649

Mã số đặt hàng: 1.16122.0500

TBX là môi trường để kiểm đếm, phát hiện và xác định vi khuẩn E.coli dương tính với β-glucuronidase từ thực phẩm, thức ăn chăn nuôi cũng như từ các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm.

Môi trường nuôi nuôi cấy này tuân theo thông số kỹ thuật được đưa ra trong tiêu chuẩn ISO 16649 phần 1 và phần 2 của EN ISO 16649 – 3.

Cách thức sử dụng

 – Sự có mặt của enzyme β-D-glucuronidase giúp phân biệt hầu hết E.coli với các vi khuẩn Coliform khác. E.coli hấp thụ cơ chất sinh màu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-glucuronide (X- β-D-glucuronide). Enzym β-glucuronidase chia đôi liên kết giữa cơ chất sinh màu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl và β-D-glucuronide. Các khuẩn lạc E.coli sau đó sẽ có màu từ màu xanh lam đến màu xanh lam lá cây.

 – Các muối mật trong thành phần và nhiệt độ nuôi cấy cao 44 °C của môi trường TBX ức chế phần lớn sự tăng sinh của các vi khuẩn Gram dương.

 – Một số chủng E.coli (3-4%) âm tính với β-D-glucuronidase sẽ biểu hiện là các khuẩn lạc không màu, ví dụ phần lớn các chủng E.coli O157 hoặc chúng không thể phát triển ở nhiệt độ cao 44 °C, ví dụ E.coli O157:H7. Để phát hiện chủng E.coli O157 cần sử dụng môi trường nuôi cấy đặc hiệu.

Thành phần môi trường

*ISO 16649 đặc biệt: 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronic acid (BCIG) 144 μmol – ví dụ: 0.075 g của muối cyclohexylammonium.
** Agar-Agar tương đương các thuật ngữ khác của thạch (agar).

Chuẩn bị

Hòa tan 31.6 g môi trường nuôi cấy TBX trong 1 L nước tinh khiết. Đun sôi và khuấy đều đến khi môi trường tan hoàn toàn. Hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 15 phút. Sau khi môi trường nguội về 45-60°C thì đổ vào các đĩa petri  hoặc dùng cho phương pháp đổ đĩa.

Môi trường nuôi cấy TBX đã pha phải trong và có màu từ vàng đến vàng nâu.

Quy trình thử nghiệm và đánh giá

Tùy thuộc vào mục đích sử dụng của môi trường.

Ủ ống nghiệm đã cấy trong điều kiện hiếu khí, ví dụ:

Theo ISO 16649 ở nhiệt độ từ 43 – 45°C trong khoảng 20-24 giờ.

Nếu có các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh lam lá cây là chỉ thị cho sự có mặt của E.coli dương tính với β-glucuronidase

Kỹ thuật đếm khuẩn lạc sử dụng màng lọc và thạch TBX theo ISO 16649-1

Phương pháp này thích hợp để đếm các tế bào của E.coli có thể đã bị yếu.

Sử dụng que cấy đã tiệt trùng, đặt màng lọc MCE 0..45um, 85mm lên trên bề mặt của một trong hai đĩa thạch MMGA (Mineral-modified glutamate agar) trong điều kiện vô trùng, thao tác cẩn thận để tránh có bọt khí phía dưới màng. Nhẹ nhàng làm phẳng các màng với que trải nếu cần thiết.

Dùng một pipet vô trùng để nhỏ 1ml mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu vào tâm của mỗi màng. Sử dụng que trải vô trùng để trải đều mẫu lên toàn bộ bề mặt, tránh tràn ra khỏi màng.

Lặp lại quy trình với các dung dịch pha loãng độ thập phân tiếp theo. Nếu cần thiết, dùng một pipet và que trải vô trùng khác cho mỗi nồng độ pha loãng.

Đặt các đĩa đã cấy theo phương nằm ngang trong 15 phút ở nhiệt độ phòng để mẫu ngấm qua màng vào thạch.

Nuôi cấy các đĩa ở 36 – 38°C trong 3 – 5 giờ, với màng/bề mặt thạch ở mặt trên.

Sau khi vi khuẩn đã phục hồi, dùng kẹp vô trùng chuyển màng từ đĩa MMGA (môi trường phục hồi) sang các đĩa thạch TBX.

Nuôi cấy các đĩa TBX ở 43-45 °C trong khoảng 20-24 giờ, với màng/bề mặt thạch ở mặt trên. Không xếp chồng quá ba đĩa.

Kiểm tra thạch TBX xem sự xuất hiện của các khuẩn lạc xanh lam hoặc xanh lam lá cây là chỉ thị có E.coli dương tính với β-glucuronidase và đếm các khuẩn lạc (CFU-colony forming units) điển hình.

Kỹ thuật đếm khuẩn lạc phương pháp cấy trải với TBX theo ISO 16649-2:

Nếu nghi ngờ vi khuẩn bị yếu, thì cần nuôi cấy vi khuẩn trong 4 giờ đầu ở 37°C, sau đó nâng nhiệt độ nuôi cấy lên 43 – 45°C trong 20-24 giờ.

Dùng pipet vô trùng, nhỏ 1ml mẫu thử hoặc nồng độ pha loãng ban đầu lên trên đĩa Petri. Lặp lại quy trình này với dung dịch pha loãng ở các thập độ tiếp theo, nếu cần, dùng một pipet vô trùng cho mỗi thập độ.

Sau đó, đổ vào mỗi đĩa Petri 15ml thạch TBX đã được làm mát về 44 – 47°C trong bể điều nhiệt.

Trộn đều mẫu thử với môi trường TBX và để đĩa thạch theo phương ngang đến khi thạch đông lại.

Thời gian từ lúc cho mẫu và môi trường vào đĩa Petri đến khi đông không được quá 15 phút.

Lật ngược và nuôi cấy đĩa thạch đã cấy ở 43 – 45°C trong khoảng 20 – 24 giờ. Tổng thời gian nuôi cấy không được quá 24 giờ.

Kiểm tra thạch TBX sự có mặt của các khuẩn lạc xanh lam hay xanh lam lá cây, chỉ thị cho E.coli dương tính với β-glucuronidase và đếm các khuẩn lạc điển hình.

Kỹ thuật MPN và kỹ thuật phát hiện E.coli theo EN ISO 16649-3

Phương pháp này thích hợp để đếm các tế bào E.coli có thể đã bị yếu do mất nước, đông lạnh và tiếp xúc với môi trường mặn (như nước biển) hoặc bị tổn thương do các chất tẩy rửa như các sản phẩm có chứa clo.

Đối với phương pháp phát hiện, Cấy một lượng xác định mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một lượng xác định huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào môi trường tăng sinh chọn lọc MMGM.

Ống nghiệm chứa mẫu đã cấy được nuôi cấy ở 36 – 38°C trong khoảng 22 – 26 giờ. Kiểm tra các ống này về sự sinh axit do lên men lactose.

Nếu ống sản sinh ra axit, thì cấy chuyển sang môi trường thạch TBX.

Nuôi cấy thạch TBX ở 43 – 45°C trong khoảng 20 -24 giờ.

Kiểm tra thạch TBX để tìm các khuẩn lạc xanh lam hoặc xanh lam lá cây, , chỉ thị cho E.coli dương tính với β-glucuronidase.

Biểu thị kết quả là có hoặc không có mặt  E.coli trong x g hoặc x ml sản phẩm.

Đối với phương pháp MPN, Cấy một lượng xác định mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một lượng xác định huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba hoặc năm ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ kép.Đối với nhuyễn thể hai mảnh vỏ tươi sống hoặc các sản phẩm khác cần đến độ chụm cao hơn, do đó cần nuôi cấy một dãy năm ống nghiệm.

Cấy một lượng xác định mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một lượng xác định huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba hoặc năm ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ đơn.

Sau đó, với cùng điều kiện trên, cấy lượng xác định các dung dịch mẫu thử pha loãng thập phân hoặc huyền phù ban đầu vào môi trường trên.

Ủ các ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép và nồng độ đơn ở 37 °C ± 1 °C trong 22 h ± 2 h. Kiểm tra các ống này về sự sinh axit do lên men lactose.

Mỗi ống môi trường có sinh axit, sẽ được cấy truyền vào môi trường thạch TBX.

Ủ thạch TBX ở 44 °C ± 1 °C trong 22 h ± 2 h. Kiểm tra trên môi trường thạch TBX sự có mặt các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh lam lá cây, cho thấy có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidase.

Số có xác suất lớn nhất Escherichia coli dương tính β-glucuronidase (ISO 7218) được xác định theo số ống môi trường được cấy truyền có sinh các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh lam lá cây trên thạch TBX  theo (ISO 7218).

Bảo quản

Bảo quản môi trường nuôi cấy dạng hạt TBX trong khoảng nhiệt độ 15 – 25 °C, ở nơi khô ráo, nắp vặn chặt. Không sử dụng nếu môi trường bị vón cục hoặc bị đổi màu. Tránh tia UV (bao gồm cả ánh sáng mặt trời). Chỉ sử dụng với các thí nghiệm trong ống nghiệm (In vitro use only).

Theo tiêu chuẩn EN ISO 16649-3 , môi trường đã chuẩn bị có thể bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 °C trong bóng tối và tránh bị làm khô trong tối đa bốn tuần, trừ kết quả xác nhận thời hạn sử dụng của phòng thí nghiệm với thời hạn sử dụng lâu hơn.

Kiểm tra chất lượng

Vui lòng tham khảo giấy chứng nhận phân tích (CoA) của lô sản phẩm thực tế.

Thử nghiệm hiệu năng tuân theo phiên bản hiện hành của EN ISO 11133.

Tỷ lệ thu hồi 50% tương đương với giá trị hiệu suất của môi trường là 0.5.

enumeration of Escherichia coli in environmental samples. Can. J. Microbiol. 34: 690–693.

Ratnam S, March S. B., Ahmed R., Bezanson G. S. and Kasatiya S. (1988): Characterization of Escherichia coli Serotype O157:H7. J. Clin. Microbiol. 26: 2006-2012.

Restaino L., Frampton E.W. and Lyon R.H. (1990): Use of chromogenic substrate 5- bromo-4-chloro-3-indolyl- β- D-glucuronide (X-GLUC) for enumeration of Escherichia coli in 24 hours from ground beef. J. Food Prot., 53: 508–510.

Mã đặt hàng

Chi tiết vui lòng liên hệ:

Merck KGaA Frankfurter Strasse 250 64293 Darmstadt, Germany Fax: +49 (0) 61 51 / 72-60 80

Để biết thêm chi tiết sản phẩm, vui lòng truy cập website: https://www.merckmillipore.com/NO/en/product/TBX-Tryptone-Bile-X-glucuronide-agar,MDA_CHEM-116122

Tải về TECHICAL DATA SHEET bản gốc tại đây

Phụ trách sản phẩm kiểm soát vi sinh (BioMonitoring) tại Việt Nam:

Miền Nam: Nguyễn Thành Khôi (Mr) – SĐT: 0987.885.819 – Email : khoi.nguyen-thanh@merckgroup.com

Miền Bắc:  Vũ Thành Khánh (Mr) – SĐT : 0914.238.458 – Email : khanh.vu-thanh@merckgroup.com