Tập 1: Quy trình chuẩn bị mẫu trong kỹ thuật Western Blotting

Tập 2: Quy trình phân tách Protein trên bản Gel SDS-PAGE

Tập 3: Kỹ thuật chuyển màng

Tập 4: Phương pháp phát hiện miễn dịch

Tập 5: Western Blotting và giải pháp xử lý sự cố

Kỹ thuật ELISA – Tổng quan và các Quy trình cơ bản

Khi cần phân tích, định lượng một protein trong mẫu, bạn sẽ lựa chọn phương pháp nào? Là điện di SDS-PAGE, là Western blotting, hay ELISA? Trong xét nghiệm miễn dịch nói chung, để định lượng protein dễ dàng, phương pháp phổ biến nhất được chọn sẽ là ELISA. Hãy cùng chúng tôi tìm hiểu ELISA là gì, có những loại ELISA nào và các bước thực hiện ra sao qua chuỗi bài viết này nhé.

I. ELISA (Enzyme-lnked immunosorbent assay) là gì?

ELISA là một kỹ thuật sinh hóa phát hiện sự hiện diện của một protein (kháng thể hay kháng nguyên) trong mẫu bằng phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Cơ chế phát hiện dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Tùy loại kỹ thuật ELISA, kháng nguyên/kháng thể được phủ lên bề mặt giếng, sau đó kháng thể thứ cấp có gắn enzyme được thêm vào, và cuối cùng cơ chất được thêm vào, phản ứng với enzyme tạo ra chất có màu/tín hiệu mà thiết bị chuyên dụng đọc được.

Ưu điểm và Nhược điểm của ELISA:

Tùy thuộc vào sự kết hợp của kháng nguyên-kháng thể mà được phân chia thành 4 loại ELISA: ELISA trực tiếp (direct ELISA), ELISA gián tiếp (indirect ELISA), ELISA sand-wich (sandwich ELISA) và ELISA cạnh tranh (competitive ELISA).

elisa

1) ELISA trực tiếp (Direct ELISA):

Trong ELISA trực tiếp, kháng nguyên bám trực tiếp trên bề mặt đĩa đa giếng và được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên. Kháng thể được gắn trực tiếp với HRP hoặc các phân tử phát hiện khác.

elisa

2) ELISA gián tiếp (Indirect ELISA):

Là kỹ thuật sử dụng 2 bước để phát hiện, trong đó kháng thể sơ cấp đặc hiệu với kháng nguyên sẽ liên kết với chất phân tích đang quan tâm, và kháng thể thứ cấp được gắn nhãn sẽ gắn với kháng thể sơ cấp của vật chủ tạo ra kháng thể đó. Sau đó mới bổ sung cơ chất để phản ứng với enzyme được gắn trên kháng thể thứ cấp. Phương pháp này có thể được sử dụng để phát hiện các kháng thể đặc hiệu trong mẫu huyết thanh bằng cách thay thế huyết thanh với kháng thể sơ cấp.

3) Sandwich ELISA

Là định dạng ELISA được dùng phổ biến nhất. Hình thức này đòi hỏi 2 kháng thể đặc hiệu với các vùng epitope khác nhau của kháng nguyên. Hai kháng thể này thường được coi thành một cặp kháng thể đi kèm. Một kháng thể được phủ trên bề mặt đĩa đa giếng và được coi là kháng thể bắt giữ, liên kết với kháng nguyên trong mẫu. Kháng thể còn lại đóng vai trò liên kết và phát hiện kháng nguyên.

4) ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA)

Kỹ thuật này đo nồng độ kháng nguyên thông qua việc phát hiện nhiễu tín hiệu. Kháng nguyên trong mẫu sẽ cạnh tranh vị trí bám đặc hiệu trên kháng thể gắn nhãn với kháng nguyên tham khảo (reference antigen). Kháng nguyên tham khảo được phủ trước trên đĩa đa giếng và mẫu được ủ trước với kháng thể gắn nhãn trước khi thêm vào giếng. Phụ thuộc vào lượng kháng nguyên trong mẫu mà lượng kháng thể nhiều hơn hay ít hơn sẽ còn lại liên kết với kháng nguyên tham khảo. Điều này có nghĩa là càng nhiều kháng nguyên trong mẫu, lượng kháng nguyên tham khảo được phát hiện càng ít và tín hiệu sẽ yếu.

Một bảng so sánh nhỏ về ưu điểm và nhược điểm của 4 loại ELISA này để mọi người tham khảo nhé:

ELISA trực tiếp

ELISA gián tiếp

Sandwich ELISA

ELISA cạnh tranh

Ưu điểm

Quy trình ngắn gọn, tiết kiệm thời gian, hóa chất. Không xảy ra phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp

Khuếch đại tín hiệu: một vài kháng thể thứ cấp sẽ bám lên kháng thể sơ cấp. Tính linh hoạt cao: cùng kháng thể thứ cấp có thể được sử dụng với vài kháng thể sơ cấp

Độ đặc hiệu cao: 2 kháng thể phát hiện vùng khác nhau của epitopes của cùng một kháng nguyên. Độ nhạy và tính linh hoạt cao: có thể sử dụng cả phương pháp trực tiếp và gián tiếp

Phụ thuộc vào việc chọn ELISA nào. Thích hợp với các kháng nguyên nhỏ

Nhược điểm

Nguy cơ nhiễu nền cao do tất cả protein trong mẫu bám lên bề mặt. Không khuếch đại được tín hiệu. Không linh hoạt do kháng thể sơ cấp phải gắn nhãn.

Quy trình dài so với ELISA trực tiếp. Có thể xảy ra nguy cơ nhiễm chéo từ kháng thể thứ cấp

Yêu cầu về thiết kế: cần tìm 2 kháng thể liên kết với cùng một kháng nguyên ở vị trí epitopes khác nhau và hoạt động tốt cùng nhau.

Phụ thuộc vào việc chọn ELISA nào

ELISA trực tiếp

Ưu điểm: Quy trình ngắn gọn, tiết kiệm thời gian, hóa chất. Không xảy ra phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp

Nhược điểm: Nguy cơ nhiễu nền cao do tất cả protein trong mẫu bám lên bề mặt. Không khuếch đại được tín hiệu. Không linh hoạt do kháng thể sơ cấp phải gắn nhãn.

ELISA gián tiếp

Ưu điểm: Khuếch đại tín hiệu: một vài kháng thể thứ cấp sẽ bám lên kháng thể sơ cấp. Tính linh hoạt cao: cùng kháng thể thứ cấp có thể được sử dụng với vài kháng thể sơ cấp

Nhược điểm: Quy trình dài so với ELISA trực tiếp. Có thể xảy ra nguy cơ nhiễm chéo từ kháng thể thứ cấp

Sandwich ELISA

Ưu điểm: Độ đặc hiệu cao: 2 kháng thể phát hiện vùng khác nhau của epitopes của cùng một kháng nguyên. Độ nhạy và tính linh hoạt cao: có thể sử dụng cả phương pháp trực tiếp và gián tiếp

Nhược điểm: Yêu cầu về thiết kế: cần tìm 2 kháng thể liên kết với cùng một kháng nguyên ở vị trí epitopes khác nhau và hoạt động tốt cùng nhau.

ELISA cạnh tranh

Ưu điểm: Phụ thuộc vào việc chọn ELISA nào. Thích hợp với các kháng nguyên nhỏ

Nhược điểm: Phụ thuộc vào việc chọn ELISA nào

Trong 4 loại kỹ thuật ELISA này thì sand-wich ELISA là phổ biến nhất nên dưới đây chúng tôi xin được gửi tới các bạn quy trình tham khảo của kỹ thuật này nhé.

II. Quy trình Sandwich ELISA

1) Đưa tất cả hóa chất và mẫu về nhiệt độ phòng (18 – 25°C) trước khi sử dụng. Khuyến cáo tất cả mẫu và chất chuẩn phải chạy tái lặp ít nhất 2 lần.

2) Thêm 100 µL mẫu và chất chuẩn vào mỗi giếng tương ứng. Che các giếng và ủ 2,5 tiếng ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4 °C có lắc nhẹ.

3) Hút bỏ dung dịch và rửa 4 lần với dung dịch đệm rửa 1X Wash Solution. Rửa bằng cách bơm vào mỗi giếng Wash Buffer (300 µL) sử dụng pipette đa kênh hoặc máy rửa đĩa tự động. Lưu ý loại bỏ hoàn toàn dung dịch đọng lại ở mỗi bước. Ở bước rửa cuối cùng, loại bỏ hoàn toàn đệm rửa Wash Buffer bằng hút bỏ hoặc gạn bỏ.Úp ngược đĩa lên một tờ giấy thấm sạch.

4) Thêm 100 µL kháng thể phát hiện (1x Detection Antibody) đã chuẩn bị sẵn vào mỗi giếng. Che phủ giếng và ủ trong vòng 1 tiếng ở nhiệt độ phòng trên máy lắc nhẹ.

elisa

5) Hút bỏ dung dịch. Lặp lại quy trình rửa như bước 3.

6) Thêm 100 µL dung dịch Streptavidin đã chuẩn bị sẵn vào mỗi giếng. Che phủ giếng và ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc nhẹ.

7) Hút bỏ dung dịch. Lặp lại quy trình rửa như bước 3.

8) Thêm 100 µL dung dịch cơ chất TMB One-Step Substrate Reagent (Item H) vào mỗi giếng. Che phủ giếng và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh sáng và trên máy lắc nhẹ.

9) Thêm 50 µL Dung dịch Stop Solution (Item I) vào mỗi giếng. Đọc ngay lập tức ở bước sóng 450 nm.

Một kỹ thuật ELISA khác cũng tương tự Sandwich ELISA là kỹ thuật ELISA Phosphoryl hóa (Phosphorylation assay), điểm khác ở đây là chúng ta sẽ sử dụng dung dịch Streptavidin có gắn HRP khi dùng kháng thể phát hiện là kháng thể biotin kháng phosphotyrosine.

Quy trình chi tiết như sau:

1) Đưa tất cả hóa chất và mẫu về nhiệt độ phòng (18 – 25°C) trước khi sử dụng. Khuyến cáo tất cả mẫu và chất chuẩn phải chạy tái lặp ít nhất 2 lần.

2) Thêm 100 µL mẫu và chất chuẩn vào mỗi giếng tương ứng. Che các giếng và ủ 2,5 tiếng ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4 °C có lắc nhẹ.

3) Hút bỏ dung dịch và rửa 4 lần với dung dịch đệm rửa 1X Wash Solution. Rửa bằng cách bơm vào mỗi giếng Wash Buffer (300 µL) sử dụng pipette đa kênh hoặc máy rửa đĩa tự động. Lưu ý loại bỏ hoàn toàn dung dịch đọng lại ở mỗi bước. Ở bước rửa cuối cùng, loại bỏ hoàn toàn đệm rửa Wash Buffer bằng hút bỏ hoặc gạn bỏ.Úp ngược đĩa lên một tờ giấy thấm sạch.

4) Thêm vào mỗi giếng 100 µL kháng thể kháng phosphotyrosine gắn biotin đã chuẩn bị sẵn. Ủ 1 tiếng ở nhiệt độ phòng trên máy lắc.

elisa

5) Hút bỏ dung dịch. Lặp lại quy trình rửa như bước 3.

6) Thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch Streptavidin-HRP vào mỗi giếng. Ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc.

7) Hút bỏ dung dịch. Lặp lại quy trình rửa như bước 3.

8) Thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch TMB One-Step Substrate Reagent (Item H). Che phủ giếng và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh sáng và trên máy lắc nhẹ.

9) Thêm 50 µL Dung dịch Stop Solution (Item I) vào mỗi giếng. Đọc ngay lập tức ở bước sóng 450 nm.

Trên đây chúng tôi vừa mang tới cho các bạn những thông tin cơ bản về kỹ thuật ELISA cũng như 2 quy trình chi tiết của Sandwgich ELISA và Phosphorylation assay. Các quy trình này nên được thực hiện theo hướng dẫn và khuyến cáo quy trình chi tiết đều có trong hướng dẫn sử dụng của mỗi kit. Hi vọng những thông tin trên đây hữu ích cho công tác chuyên môn của bạn nhé.

Tham khảo thêm thông tin và đặt hàng tại đây: https://www.sigmaaldrich.com/SG/en/applications/protein-biology/elisa

Tham khảo tài liệu về kit sandwich ELISA tại đây.

XEM THÊM

PHARMA DAY – Ngày hội ngành Dược lĩnh vực phân tích & QC

nhằm cập nhật, chia sẻ những thông tin mới nhất về giải pháp toàn diện cho phòng phân tích QC Dược hiện đại, Merck Việt Nam đã long trọng tổ chức sự kiện PHARMA Day với chủ đề “Xu hướng và giải pháp toàn diện cho phòng phân tích QC Dược hiện đại” vào ngày 14/09/2022 tại khách sạn Park Royal, TP.Hồ Chí Minh.

Read More »

    TƯ VẤN
    SẢN
    PHẨM TỪ MERCK