Chuỗi bài viết về nghiên cứu protein
Tập 4: Western Blot – Phương pháp phát hiện miễn dịch
Ở bài trước các bạn đã có cái nhìn tổng quát về:
– Quy trình chuẩn bị mẫu trong kỹ thuật Western Blot (link xem lại tại đây: https://blog.merck-lifescience.com.vn/chuoi-bai-viet-ve-nc-protein-tap-1/)
– Điện di SDS-PAGE (https://blog.merck-lifescience.com.vn/chuoi-bai-viet-ve-nghien-cuu-protein-tap-2/)
– Chuyển màng (https://blog.merck-lifescience.com.vn/chuoi-bv-ve-nhien-cuu-protein-tap-3/).
Trong bài viết cuối cùng của series về kỹ thuật Western blotting, chúng tôi sẽ trình bày về phương pháp phát hiện miễn dịch sử dụng kháng thể gắn peroxidase nhé.
Phương pháp phát hiện miễn dịch
Hiện nay phổ biến nhất vẫn là phương pháp phát hiện miễn dịch dùng sử dụng kháng thể gắn peroxidase hoặc phosphatase nên trong bài viết này sẽ chỉ đề cập tới quy trình này.
1. Nguyên liệu cần thiết
• Kháng thể sơ cấp và thứ cấp
• Máy lắc Orbital shaker* ( Z768499)
• Khay chứa sâu 2-3 mm, to hơn kích thước màng hoặc spot protein
• Cơ chất phát hiện (nếu sử dụng kháng thể gắn peroxidase hoặc phosphatase)
• Cơ chất hóa phát quang
• Cơ chất tạo sắc tố
*Máy lắc và khay chứa chỉ cần với phương pháp phát hiện miễn dịch truyền thống; với phát hiện miễn dịch bằng hút chân không nhanh chóng, sử dụng hệ thống SNAP i.d.® (tham khảo quy trình SNAP i.d.® immunodetection protocol.)
2. Ủ kháng thể
– Bước 1: Ủ màng trong dung dịch blocking và lắc nhẹ trong 1 giờ.
– Bước 2: Rửa với dung dịch đệm rửa PBS trong 5-10 phút.
– Bước 3: Ủ màng với dung dịch kháng thể sơ cấp, ví dụ Monoclonal Anti-Beta-Actin Antibody và lắc nhẹ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc 4 độ C qua đêm. Dung dịch cần được loại bỏ sạch hoàn toàn khỏi màng sau ủ. Có thể thu hồi lại kháng thể sơ cấp cho các lần kế tiếp.
– Bước 4: Rửa màng với PBS trong 10 phút. Lặp lại 2 lần với dung dịch đệm mới.
– Bước 5: Ủ màng với dung dịch kháng thể thứ cấp và ủ trong 1 giờ ở RT hoặc 37 °C.
– Bước 6: Rửa màng với PBS trong 10 phút. Lặp lại 2 lần với dung dịch đệm mới.
– Bước 7: Thực hiện phát hiện huỳnh quang, hóa phát quang hoặc cơ chất tạo sắc tố..
Tham khảo thêm tại:
• Phát hiện Proteins bằng Hóa phát quang và tạo sắc tố
• Phát hiện miễn dịch sử dụng cơ chất BCIP/NBT
3. Phát hiện bằng Hóa phát quang
Làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
– Bước 1: Chuẩn bị cơ chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
– Bước 2: Đặt màng trong khay chứa và nhỏ cơ chất phủ màng hoàn toàn.
– Bước 3: Ủ trong khoảng 1 phút.
– Bước 4: Hút bỏ cơ chất.
– Bước 5: Đặt màng lên tấm kính sạch
– Bước 6: Nhẹ nhàng loại bong bóng.
– Bước 7: Trong phòng tối, đặt màng lên khay phim trong máy phát hiện.
– Bước 8: Phơi ảnh. Phơi đa ảnh từ 15 giây tới 30 phút để chọn thời gian phơi tối ưu; thông thường từ 1-5 phút.
Cơ chất sử dụng trong bước này, các bạn có thể tham khảo sản phẩm Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (WBKLS) sử dụng được với cả 2 loại màng nitrocellulose và PVDF nhé.
Trên đây là quy trình Western blotting cơ bản để các bạn hình dung và tham khảo cho thí nghiệm của mình. Ở bài viết sau, chúng tôi sẽ nói về một số vấn đề thường gặp cũng như gợi ý hướng giải quyết khi thực hiện Western blotting.
Các bạn có thể tham khảo thêm sản phẩm tại đây: Link tham khảo: https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/protocol/protein-biology/gel-electrophoresis/sds-page
Tải và xem prochure tại đây.
Chúc các bạn thành công!
