Lưu Ý: Quý khách hàng có thể dùng mã sản phẩm, CAS number trong các brochure để tra cứu thông tin chi tiết như giá, giấy phép, ứng dụng sản phẩm, thông tin an toàn… trên Merck Eshop.

BLOT OUT ERRORS – Tối ưu kỹ thuật Western Blot

Sản phẩm Hóa sinh cho Western Blot

Western blot là một trong những kỹ thuật nền tảng để phát hiện protein. Tuy nhiên, phương pháp này cũng mang đến rủi ro kết quả không nhất quán, độ nhiễu nền cao và độ nhạy thấp vì phương pháp qua nhiều bước thực hiện và sử dụng nhiều loại thuốc thử.

Là một trong những đối tác về sản phẩm hóa sinh hàng đầu thế giới, chúng tôi không chỉ cung cấp các quy trình chi tiết mà còn cung cấp đầy đủ các loại thuốc thử và thiết bị chất lượng cao cho từng bước của quy trình: từ biến tính protein và điện di trên gel đến liên kết và phát hiện kháng thể .

Các sản phẩm hóa sinh của chúng tôi là trợ thủ đắc lực giúp duy trì công việc trôi chảy và tối ưu hóa quy trình làm việc của bạn.

Lưu đồ Western Blot

Trích ly và tinh sạch Protein: Tách protein từ tế bào bằng cách sử dụng đệm ly giải tế bào SDS với protease và các chất ức chế khác. Tinh sạch và định lượng tổng số protein bằng BCA hoặc Bradford Assay.
Chuẩn bị mẫu: Pha loãng 20 – 50ug protein mỗi mẫu với dung dịch đệm pha loãng SDS và chất nhuộm màu. Làm biến tính mẫu bằng nhiệt sau đó làm nguội trước khi nạp vào giếng.
Điện di gel: Cho gel vào bể có đệm đang chạy. Cẩn thận nạp mẫu và thang protein vào giếng. Chạy gel ở điện áp và thời gian được khuyến nghị cho gel protein và thiết bị.
Chuyển màng: Chuẩn bị màng PVDF hoặc Nitrocellulose, đệm chuyển và gel. Tạo dạng kẹp sandwich bằng gel, màng và miếng xốp để chuyển ướt hoặc bán khô.
Bước ủ khoá màng: Sử dụng phương pháp ủ khoá màng nhờ protein với sữa gầy hoặc BSA. Hoặc ủ khoá màng hoá học không dùng protein

Bổ sung kháng thể: Dùng 1° IgG antibody với độ đặc hiệu cao đối với các epitope protein. Khuếch đại tín hiệu bằng cách sử dụng 2 ° IgG Ab nhắm vào các loài 1 ° IgG Ab.

Mẹo và thủ thuật

Tiết kiệm thời gian, đúc sẵn gel trước. Bọc mỗi gel trong một chiếc khăn giấy thấm dung dịch đệm sau đó cho vào túi nhựa. Bảo quản ở nhiệt độ 4°C để sử dụng trong 2 – 3 tuần tiếp theo.
Sử dụng APS 10% mới hoặc nguyên liệu đông lạnh mỗi khi đúc gel để trùng hợp nhất quán.
Giảm các protein có liên kết disulfide bằng cách sử dụng DTT trong quá trình chuẩn bị mẫu.
Loại bỏ acrylamide không được trùng hợp bằng cách rửa nhẹ các giếng bằng đệm chạy trước khi nạp mẫu.
Tránh làm quá tải các giếng và chạy gel ở điện áp thấp hơn để tránh các dải gây nhiễu.
Giảm nồng độ sữa gầy có thể làm tăng cường độ tín hiệu.
Màng PVDF đáng tin cậy hơn so với nitrocellulose để loại bỏ. Sử dụng phương pháp có tính axit hoặc chất tẩy rửa để loại bỏ.

Hướng dẫn chọn Gel cho protein đích

Chọn đúng nồng độ acrylamide và loại gel là rất quan trọng. Sau đó, ghép nối nó với một bộ đệm chạy phù hợp sẽ giúp tăng thành công cho Western Blotting của bạn. Sử dụng các mẹo và hướng dẫn gel của chúng tôi để giúp loại bỏ các lỗi mà bạn thường mắc phải.

Khối lượng phân tử Protein là chìa khóa

Gel điện di Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) là một kỹ thuật bán định lượng được sử dụng để phân tách protein theo trọng lượng phân tử (MW) để phân tích sự biểu hiện của protein. SDS là chất tẩy rửa anion được sử dụng để làm biến tính protein và truyền điện tích âm so với khối lượng protein.

PAGE loại bỏ SDS và các protein sẽ di chuyển theo cấu trúc, điện tích tự nhiên và kích thước ban đầu của chúng.

Trọng lượng phân tử của protein đích sẽ xác định loại gel hóa học nào là cần thiết. Gel polyacrylamide có thể được tạo ra ở nồng độ đơn hoặc với dải (4% – 15%). Một dải được sử dụng khi phân tích nhiều protein đích trong một mẫu có phạm vi kích thước rộng. Khi các protein đích có kích thước tương tự hoặc khi xác định một protein đích duy nhất, thì gel đơn sẽ thích hợp hơn để tách. Nồng độ acrylamide cao hơn dẫn đến lỗ nhỏ hơn. Trong quá trình phân tách nói chung có MW lớn, các protein cần lượng gel thấp hơn và tách các protein có MW nhỏ yêu cầu lượng gel cao.

Kết nối với các loại Gel và Bộ đệm

Việc chọn đúng gel sau đó ghép nối nó với bộ đệm chính xác sẽ ảnh hưởng đến cách các protein sẽ chạy và phân tách trong quá trình điện di trên gel. Các bảng sau đây sẽ hướng dẫn bạn cách chọn gel phù hợp cho protein của bạn và các chất hóa sinh tốt nhất cho tất cả các ứng dụng nghiên cứu của bạn.

Các cấp sản phẩm của chúng tôi chỉ ra chất lượng và mức độ tạp chất thích hợp cho các ứng dụng khác nhau và các tiêu chuẩn quy định.

Chúng tôi cung cấp các hóa chất cho việc sử dụng trong phòng thí nghiệm thông thường, các ứng dụng chẩn đoán, sản xuất và nghiên cứu có thể cần kiểm tra kim loại hoặc mức độ tinh khiết được chỉ định.