BLOT OUT ERRORS – Tối ưu kỹ thuật Western Blot
Sản phẩm Hóa sinh cho Western Blot
Western blot là một trong những kỹ thuật nền tảng để phát hiện protein. Tuy nhiên, phương pháp này cũng mang đến rủi ro kết quả không nhất quán, độ nhiễu nền cao và độ nhạy thấp vì phương pháp qua nhiều bước thực hiện và sử dụng nhiều loại thuốc thử.
Là một trong những đối tác về sản phẩm hóa sinh hàng đầu thế giới, chúng tôi không chỉ cung cấp các quy trình chi tiết mà còn cung cấp đầy đủ các loại thuốc thử và thiết bị chất lượng cao cho từng bước của quy trình: từ biến tính protein và điện di trên gel đến liên kết và phát hiện kháng thể .
Các sản phẩm hóa sinh của chúng tôi là trợ thủ đắc lực giúp duy trì công việc trôi chảy và tối ưu hóa quy trình làm việc của bạn.
Lưu đồ Western Blot
- Trích ly và tinh sạch Protein: Tách protein từ tế bào bằng cách sử dụng đệm ly giải tế bào SDS với protease và các chất ức chế khác. Tinh sạch và định lượng tổng số protein bằng BCA hoặc Bradford Assay.
- Chuẩn bị mẫu: Pha loãng 20 – 50ug protein mỗi mẫu với dung dịch đệm pha loãng SDS và chất nhuộm màu. Làm biến tính mẫu bằng nhiệt sau đó làm nguội trước khi nạp vào giếng.
- Điện di gel: Cho gel vào bể có đệm đang chạy. Cẩn thận nạp mẫu và thang protein vào giếng. Chạy gel ở điện áp và thời gian được khuyến nghị cho gel protein và thiết bị.
- Chuyển màng: Chuẩn bị màng PVDF hoặc Nitrocellulose, đệm chuyển và gel. Tạo dạng kẹp sandwich bằng gel, màng và miếng xốp để chuyển ướt hoặc bán khô.
- Bước ủ khoá màng: Sử dụng phương pháp ủ khoá màng nhờ protein với sữa gầy hoặc BSA. Hoặc ủ khoá màng hoá học không dùng protein
Bổ sung kháng thể: Dùng 1° IgG antibody với độ đặc hiệu cao đối với các epitope protein. Khuếch đại tín hiệu bằng cách sử dụng 2 ° IgG Ab nhắm vào các loài 1 ° IgG Ab .
Mẹo và thủ thuật
- Tiết kiệm thời gian, đúc sẵn gel trước. Bọc mỗi gel trong một chiếc khăn giấy thấm dung dịch đệm sau đó cho vào túi nhựa. Bảo quản ở nhiệt độ 4°C để sử dụng trong 2 – 3 tuần tiếp theo.
- Sử dụng APS 10% mới hoặc nguyên liệu đông lạnh mỗi khi đúc gel để trùng hợp nhất quán.
- Giảm các protein có liên kết disulfide bằng cách sử dụng DTT trong quá trình chuẩn bị mẫu.
- Loại bỏ acrylamide không được trùng hợp bằng cách rửa nhẹ các giếng bằng đệm chạy trước khi nạp mẫu.
- Tránh làm quá tải các giếng và chạy gel ở điện áp thấp hơn để tránh các dải gây nhiễu.
- Giảm nồng độ sữa gầy có thể làm tăng cường độ tín hiệu.
- Màng PVDF đáng tin cậy hơn so với nitrocellulose để loại bỏ. Sử dụng phương pháp có tính axit hoặc chất tẩy rửa để loại bỏ.
Các chọn lựa về Gel
Tham khảo tài liệu ứng dụng chi tiết tại đây
Loading…
Loading…
Reload document 
Open in new tab
Xếp loại thuốc thử và Ứng dụng
Một số thuốc thử thông dụng.
