Chuỗi bài viết về nghiên cứu protein

Tập 5: Western Blotting_Giải pháp xử lý sự cố

Western blotting_Troubleshooting

Trong chuỗi chia sẻ về nghiên cứu protein, các bạn đã có bức tranh khá chi tiết về nguyên lý, từng bước thực hiện cũng như các hóa sinh phẩm cần thiết để thực hiện kỹ thuật Western blotting.

Tập 1: Quy trình chuẩn bị mẫu trong kỹ thuật Western Blotting

Tập 2: Quy trình phân tách Protein trên bản Gel SDS-PAGE

Tập 3: Kỹ thuật chuyển màng

Tập 4: Phương pháp phát hiện miễn dịch

Tuy nhiên, không phải lúc nào kết quả chúng ta cũng thu được như mong đợi mà sẽ có một số vấn đề xảy ra trong quy trình thực hiện. Trong bài viết này, chúng tôi tổng hợp lại một số “tip” cũng như hướng khắc phục cơ bản nhất, như là một tài liệu tham khảo cho các bạn nhé.

NỘI DUNG
giải pháp xử lý sự cố Western Blotting

1.Giải pháp xử lý sự cố Western Blotting – Không có tín hiệu, tín hiệu yếu hoặc không có băng đặc hiệu

Đây có lẽ là một trong những kết quả hay khiến chúng ta “bất ngờ nhất” khi đọc kết quả Western blotting. Bạn sẽ nghĩ sao khi thấy màng của mình hiện lên trắng tinh hay băng protein mình đang cần phát hiện lại “không có”? Dưới đây là một số khả năng có thể xảy ra dẫn tới kết quả không mong đợi này nhé:

Nguyên nhân có thể

Giải pháp

Cơ chất hoặc chất liên hợp yếu hoặc mất hoạt tính do quá hạn sử dụng hoặc bảo quản không đúng cách

Kiểm tra hoạt tính của cơ chất và chất liên hợp. VD. cho enzyme liên hợp vào dung dịch cơ chất, nếu có hoạt tính thì màu sẽ thay đổi

Nếu đã sử dụng phát hiện hóa phát quang, dung dịch tạo ảnh film có thể hết hạn

Sử dụng dung dịch tạo ảnh film mới pha

Dùng sai cơ chất

Đảm bảo chọn đúng cơ chất phù hợp với enzyme liên hợp

Chuẩn bị cơ chất không đúng

Thực hiện đúng hướng dẫn của cơ chất. Đảm bảo H2O2 được sử dụng mới

Kháng thể sơ cấp hoặc thứ cấp pha loãng không đúng

Kiểm tra hướng dẫn sử dụng hoặc tài liệu khuyến cáo tỷ lệ pha loãng các kháng thể. Pha quá mức không tốt hơn, đặc biệt với hệ thống phát hiện nhạy như hóa phát quang. Phần lớn các kháng thể được kiểm tra với cơ chất tạo màu thường không nhạy. Vì lý do này, kháng thể chỉ cần pha loãng thêm 5-10 lần nếu sử dụng phương pháp phát hiện hóa phát quang.

Kháng thể sơ cấp sử dụng sai ứng dụng

Đảm bảo kháng thể được sử dụng phù hợp với immunoblotting. Không phải kháng thể nào cũng dùng được cho mọi ứng dụng. Kháng thể sơ cấp có thể không phản ứng với protein từ các loài mà ta đang quan tâm. Kiểm tra hướng dẫn sử dụng/tài liệu và thông tin trình tự protein đó.

Protein đang quan tâm không có hoặc có ở nồng độ cực thấp

Nếu chứng dương có hiển thị, kiểm tra lại lượng protein được nạp. Nếu cần thiết, nên làm giàu lượng protein mình quan tâm trong mẫu nạp bằng phương pháp tinh sạch hoặc tủa miễn dịch. Tham khảo tài liệu để có được lượng protein tốt nhất. Có thể tham khảo mục “Lượng protein chuyển màng kém” bên dưới.

Sử dụng kháng thể thứ cấp không phù hợp

Kháng thể thứ cấp có thể không bám kháng thể sơ cấp. Kiểm tra điều này bằng cách nhỏ một giọt kháng thể sơ cấp lên tấm màng nhỏ. Khi giọt khô, block, sau đó nhỏ lên dung dịch kháng thể thứ cấp đã pha loãng (probe with diluted secondary), rửa sạch và cho phản ứng với cơ chất. Giọt tròn sẽ xuất hiện nếu kháng thể thứ cấp bám kháng thể sơ cấp.

Thời gian ủ không thích hợp

Ủ ít nhất một giờ với kháng thể sơ cấp.

Còn chất ức chế enzyme

Sodium azide sẽ ức chế phản ứng peroxidase

Rửa quá mức

Giảm thời gian rửa, loại bỏ chất tẩy rửa (detergent) trong đệm rửa.

Protein chuyển lên màng kém

Kiểm tra việc protein chuyển lên màng bằng cách nhuộm màng với Ponceau S (mã P7170) trước khi blocking. Đảm bảo màng ướt đều trước khi chuyển màng. Kiểm tra thời gian chuyển. Với protein nhỏ (<10.000) có thể chuyển xuyên qua màng (có thể thử bằng cách áp tấm màng thứ 2 sau tấm màng 1). Với protein lớn hơn có thể yêu cầu thời gian chuyển màng lâu hơn. Kiểm tra dung dịch đệm chuyển màng-nồng độ methanol cao có thể ngăn protein chuyển từ gel lên màng. Thêm 0,005-0,01% SDS vào đệm chuyển có thể tăng khả năng chuyển protein lên màng, nhưng cũng có thể ảnh hưởng độ bám của protein trên màng. Nếu điểm đẳng điện (pI) của protein >9,0 có thể sử dụng CAPS, pH 9 làm đệm chuyển.

2. Giải pháp xử lý sự cố Western Blotting – Nhiễu nền hoặc băng không đặc hiệu

Nguyên nhân có thể

Giải pháp

Blocking không đủ

Sử dụng các cách blocking khác nhau: Tăng thời gian ủ, tăng % thành phần blocking, hóa chất blocking khác, thêm hóa chất blocking trong dung dịch pha loãng kháng thể hoặc sử dụng blocking mới.

Kháng thể sơ cấp không đủ đặc hiệu

Hãy thử sử dụng kháng thể đơn dòng hoặc kháng thể đa dòng tinh sạch ái lực.

Nồng độ kháng thể sơ cấp cao

Kiểm tra tài liệu hoặc hướng dẫn sử dụng khuyến cáo tỷ lệ pha loãng kháng thể sơ cấp. Hãy thử các dải pha loãng để tìm ra tỷ lệ tối ưu cho bạn.

Nồng độ kháng thể thứ cấp cao

Hãy thử bằng cách chạy thêm một giếng mẫu và không ủ với kháng thể sơ cấp. Nếu giếng “kháng thể thứ cấp” cho kết quả nhuộm không đặc hiệu, hãy thử pha loãng thêm kháng thể thứ cấp hoặc thử một loại khác.

Kháng thể thứ cấp nhiễm chéo với protein trong mẫu

Pha loãng kháng thể sơ cấp trong đệm chứa 1-5% huyết thanh thường từ cùng loài trong mẫu.

Đa băng có thể là các mảnh protein bị phân rã từ protein mình đang quan tâm

Đảm bảo có chất ức chế protease có trong bước đầu tiên khi chuẩn bị mẫu. Bảo quản và xử lý mẫu cẩn thận tránh tình trạng phân hủy protein. Hãy sử dụng mẫu mới, tươi nếu có thể.

Ủ kháng thể lâu hơn cần thiết

Rút ngắn thời gian ủ.

Ủ quá mức với dung dịch cơ chất màu

Giảm thời gian nhuộm. Phơi màng với cơ chất cho tới khi thấy tín hiệu dương tính. Dừng phản ứng bằng cách rửa màng trước khi nền màng hiện lên.

Rửa không đúng

Tăng số lần rửa hoặc thêm chất tẩy rửa trong đệm rửa.

Nhiễm enzyme

Kiểm tra mẫu với riêng cơ chất để kiểm tra hoạt tính enzyme nhiễm trong mẫu protein.

Trên đây là một số tổng hợp của chúng tôi về nguyên nhân cũng như cách khắc phục kết quả không mong đợi trong thí nghiệm Western blotting. Ngoài ra, bạn có thể tham khảo tại tài liệu này. Hi vọng qua bài viết này, kết quả thí nghiệm của bạn sẽ “đẹp” lên nhé. Chúc các bạn thành công!

XEM THÊM

PHARMA DAY – Ngày hội ngành Dược lĩnh vực phân tích & QC

nhằm cập nhật, chia sẻ những thông tin mới nhất về giải pháp toàn diện cho phòng phân tích QC Dược hiện đại, Merck Việt Nam đã long trọng tổ chức sự kiện PHARMA Day với chủ đề “Xu hướng và giải pháp toàn diện cho phòng phân tích QC Dược hiện đại” vào ngày 14/09/2022 tại khách sạn Park Royal, TP.Hồ Chí Minh.

Read More »

    TƯ VẤN
    SẢN
    PHẨM TỪ MERCK