XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIURET

Protein là các phân tử sinh học lớn và tham gia vào nhiều quá trình sinh lý trong sinh vật. Chúng bao gồm các chuỗi dài các axit amin được kết nối bởi các liên kết peptide. Định lượng protein là một lĩnh vực quan trọng trong phân tích sinh học. Có nhiều phương pháp khác nhau để định lượng nồng độ protein trong mẫu. 

Trong bài viết này, chúng tôi sẽ giới thiệu phương pháp Biuret và quy trình thực hiện thí nghiệm dựa trên kỹ thuật đo quang phổ với thiết bị Spectroquant® Prove (phiên bản firmware 1.5 trở lên) và tất cả các thuốc thử cần thiết cho phép đo được bao gồm trong bộ dụng cụ thử nghiệm.

1. Tổng quan phương pháp BIURET 

Protein tạo thành một phức hợp màu xanh tím trong dung dịch kiềm đồng sunfat  có chứa tartrate (thuốc thử Biuret). Sự hấp thụ của hợp chất này sẽ đo được ở bước sóng 546 nm. 

Khoảng đo: 

• – 0,5–5,0 g/l protein như albumin huyết thanh bò (phương pháp “Protein Biuret LR”, số 315) 
• – 1–10 g/l protein như albumin huyết thanh bò (phương pháp “Protein Biuret HR”, số 316) 

Mẫu thử nghiệm: Mẫu dạng lỏng hoặc mẫu sau khi qua quá trình chuẩn bị thích hợp. 

2. Thuốc thử và dụng cụ thử nghiệm BIURET 

3. Quy trình thực hiện xác định protein bằng phương pháp BIURET 

Chuẩn bị mẫu 

Dung dịch mẫu thí nghiệm cần ở trạng thái trong suốt. Nên thực hiện ly tâm hoặc lọc các mẫu đục trước khi thực hiện thí nghiệm. 

– Đối với các mẫu màu và mẫu có hàm lượng protein thấp (< 0,5 g/l): protein nên được kết tủa từ một thể tích được xác định bằng dung dịch axit trichloroacetic và sau đó được hóa tan lại trong một thể tích (nhỏ hơn) của nước cất hoặc dung dịch đệm. 

Chuẩn bị axit trichloroacetic (dung dịch TCA): Cẩn thận hòa tan 5 g axit trichloroacetic (Cat. No. 100807) trong 10 ml nước tinh khiết (50% (w /v). 

Quy trình kết tủa: thêm 0,2 ml 50 % (w/v) dung dịch TCA cho mỗi 1 ml dung dịch mẫu, trộn và ly tâm. Loại bỏ dung dịch và hòa tan kết tủa trong một khối lượng nước cất nhỏ hơn. 

Các mẫu có hàm lượng protein cao (>10g/l): mẫu cần được pha loãng với nước cất hoặc dung dịch đệm. 

Chuẩn bị dung dịch đo lường 
Quá trình chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng sẽ phụ thuộc vào phương pháp thực hiện. Cụ thể như sau: 

Tiến hành đo mẫu 

• Mở danh sách phương pháp () và chọn phương pháp số 315 “Protein Biuret LR” hoặc phương pháp số 316 “Protein Biuret HR”. 
• Nên thực hiện đo Zero phương pháp mỗi ngày làm việc mới. Để làm điều này, hãy mở phương pháp, chọn và chọn <ZERO ADJUSTMENT> trên menu. Làm theo các hướng dẫn được hiển thị trên màn hình. 
• Sau đó thực hiện đo mẫu trắng (nên làm lại cho mỗi ngày làm việc mới). Làm điều này bằng cách chọn vào và chọn trên mục menu. Đổ đầy cuvet nhựa hình chữ nhật 10 mm với thuốc thử trắng đặt vào ngăn chứa cuvet. Phép đo được thực hiện tự động. Chấp nhận kết quả mẫu trắng bằng cách kích hoạt trường và xác nhận với . 

• Nếu có bước pha loãng, nhập hệ số pha loãng. Làm điều này bằng cách chọn vào nút và chọn trên mục menu. Nhập hệ số pha loãng ở dạng 1 +x. 
• Đo mẫu bằng cách rót mẫu mẫu đo vào cuvet nhựa hình chữ nhật 10 mm và gắn cuvet vào ngăn đo. Phép đo bắt đầu tự động. 
• Đọc kết quả với đơn vị g/l từ màn hình. 

Lưu ý: Nếu một bước kết tủa đã được thực hiện, kết quả của mẫu ban đầu phải được tính toán thủ công bằng cách chia kết quả hiển thị với hệ số làm giàu tương ứng. 

Truyền dữ liệu từ Prove spectrophotometers  

Sau khi đo, dữ liệu kết quả từ máy quang phổ PROVE được chuyển bằng phần mềm “Prove Connect to LIMS” 

Ảnh hưởng của các hợp chất lạ 

Phương pháp Biuret thường ít chịu ảnh hưởng của các chất tạp. Tuy hiên, một số hợp chất như amoni sulfate, Tris, glycerol và saccharose có thể gây ảnh hưởng đến phép đo. Nếu có sự hiện diện của các chât trên, nên thực hiện phương pháp kết tủa TCA trước khi đo. Bên cạnh đó, lipid cũng có thể gây ảnh hưởng vì tạo độ đục. Xử lý bằng cách thêm tối đa 3% natri deoxycholate để hạn chế vấn đề này. 

4. Hiệu chuẩn 

Chúng tôi khuyên bạn nên kiểm tra chức năng hiệu chuẩn được lập trình sẵn của các phương pháp cho mỗi lô của bộ thử nghiệm mới. Với mục đích này, một giải pháp tiêu chuẩn albumin với nồng độ ở giữa phạm vi đo có thể được sử dụng làm dung dịch mẫu. Nếu phát hiện sai lệch đáng kể, phương pháp nên được hiệu chỉnh lại. Hơn nữa, phương pháp hiệu chuẩn do người dùng xác định có thể hữu ích nếu một chất tham chiếu khác ngoài albumin huyết thanh bò được sử dụng. 

Chuẩn bị các chuẩn để tiến hành hiệu chuẩn 

Hiệu chuẩn có thể được thực hiện với thực tế bất kỳ protein đồng nhất và tinh khiết nào. Albumin huyết thanh bò (BSA) thường được sử dụng như một chất tham chiếu. 
Để chuẩn bị một dung dịch tiêu chuẩn, hòa tan chính xác 1 g BSA (Cat. No. 112018) trong 100 ml nước trong bình thể tích. Dung dịch chuẩn này (10g/l) sau đó có thể được pha loãng theo yêu cầu:  

Hiệu chuẩn phương pháp do người dùng xác định 

• Mở danh sách phương pháp (<Methods>) và chọn phương pháp số 315 “Protein Biuret LR” hoặc phương pháp số 316 “Protein Biuret HR”. 
• Nên thực hiện đo Zero phương pháp mỗi ngày làm việc mới. Để làm điều này, hãy mở phương pháp, chọn <Settings> và chọn trên mục menu. Làm theo các hướng dẫn được hiển thị trên màn hình. 
• Bấm chọn <Settings> và chọn trên mục menu.  
• Bấm ba lần vào <+> trong bàn phím số để tạo thêm ba dòng đầu vào. 
• Chọn “Absorbance” trong dòng“E0” (các trường đã chọn được hiển thị trong khung màu xanh). 

• Rót dung dịch chuẩn E0 vào cuvet hình chữ nhật 10 mm và chèn vào ngăn đo. Phép đo bắt đầu tự động. Độ hấp thụ đo được thể hiện trong màn hình. 
• Chọn “Conc.”  trong dòng “1” và nhập nồng độ 0.5 g/l đối với phương pháp 315 hoặc 1 g/l cho phương pháp 316 cho lần hiệu chuẩn đầu tiên. Chọn “Absorbance” trong dòng “1”. Rót dung dịch hiệu chuẩn 1 vào cuvet chữ nhật 10 mm bằng nhựa đặt vào cuvet vào ngăn đo. Phép đo bắt đầu tự động. Độ hấp thụ đo được thể hiện trong màn hình. 
• Chọn “Conc.” trong dòng “2” và nhập nồng độ là 1.0 g/l đối với phương pháp 315 hoặc 2 g/l cho phương pháp 316 cho giải pháp hiệu chuẩn thứ hai. Chọn “Absorbance” trong dòng “2”. Rót dung dịch hiệu chuẩn 2 vào cuvet chữ nhật 10 mm bằng nhựa đặt vào cuvet vào ngăn đo. Phép đo bắt đầu tự động. Độ hấp thụ đo được thể hiện trong màn hình. 
• Chọn “Conc.” trong dòng “3” và nhập nồng độ là 2.0 g/l đối với phương pháp 315 hoặc 4 g/l cho phương pháp 316 cho giải pháp hiệu chuẩn thứ ba. Chọn “Absorbance” trong dòng “3” . Rót dung dịch hiệu chuẩn 3 vào cuvet chữ nhật 10 mm bằng nhựa đặt vào cuvet vào ngăn đo. Phép đo bắt đầu tự động. Độ hấp thụ đo được thể hiện trong màn hình. 
• Chọn “Conc.” trong dòng “4” và nhập nồng độ là 3.0 g/l đối với phương pháp 315 hoặc 6 g/l cho phương pháp 316 cho hiệu chuẩn thứ tư. solution Select the “Absorbance” field in the “4” line.”. Rót dung dịch hiệu chuẩn 4 vào cuvet chữ nhật 10 mm bằng nhựa đặt vào cuvet vào ngăn đo. Phép đo bắt đầu tự động. Độ hấp thụ đo được thể hiện trong màn hình. 

• Chọn “Conc.” trong dòng “5” và nhập nồng độ 4.0 g/l đối với phương pháp 315 hoặc 8 g/l cho phương pháp 316 cho giải pháp hiệu chuẩn thứ năm. Chọn “Absorbance” trong dòng “5”. Rót dung dịch hiệu chuẩn 5 vào cuvet chữ nhật 10 mm bằng nhựa đặt vào cuvet vào ngăn đo. Phép đo bắt đầu tự động. Độ hấp thụ đo được thể hiện trong màn hình. 
• Chọn “Conc.” trong dòng “6” và nhập nồng độ của 5.0 g/l đối với phương pháp 315 hoặc 10 g/l cho phương pháp 316 cho giải pháp hiệu chuẩn thứ năm. Chọn “Absorbance” trong vòng “6”. Rót dung dịch hiệu chuẩn 5 vào cuvet chữ nhật 10 mm bằng nhựa đặt vào cuvet vào ngăn đo. Phép đo bắt đầu tự động. Độ hấp thụ đo được thể hiện trong màn hình. 
• Kích hoạt , và . Tùy chọn nhập số lô để hiệu chuẩn, chọn để chọn. 
• Khi tất cả các dung dịch hiệu chuẩn đã được đo, hãy lưu hiệu chuẩn bằng cách nhấn . 

5. Đảm bảo chất lượng thử nghiệm 

Mục tiêu đảm bảo chất lượng phân tích (AQA) là để đảm bảo kết quả đo lường chính xác. AQA nên được thực hiện trước mỗi chuỗi đo. Để kiểm tra hệ thống đo lường (thuốc thử, thiết bị đo và vận hành) một giải pháp tiêu chuẩn albumin huyết thanh bò tự chuẩn bị có thể được sử dụng. Để biết chi tiết về cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn, hãy xem phần chuẩn bị chuẩn các dung dịch tiêu chuẩn. Nhiễu phụ thuộc vào mẫu (hiệu ứng ma trận) có thể được xác định bằng các bổ sung tiêu chuẩn. 

Để biết chi tiết về cách thực hiện kiểm tra AQA, hãy xem hướng dẫn sử dụng cụ thể của thiết bị. 

6. Kết luận 

Bộ xét nghiệm Protein (Biuret) là một cách dễ dàng và nhanh chóng để phân tích nồng độ protein trong mẫu của bạn. Việc đo lường có thể được thực hiện mà không cần thiết bị đắt tiền. Phương pháp được lập trình sẵn trên máy Spectroquant^® Prove có firmware phiên bản 1.5 trở lên. 

Tài liệu tham khảo 

1. Kresze, G.-B.; in: Meth. Enz. Anal, (Bergmeyer, H. U., u. Graßl, M., eds.), Vol.2, 86–88 3rd ed., Verlag Chemie, Weinheim (1983) 

2. Doumas, B. T., et al.; Clin. Chem. 27, 1642–1650 und 1651–1654 (1981) 

3. Amtl. Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG: L 06.00–23 (Mai 1986), L 07.00 36 (Mai 1986) und L 08.00–28 (Mai 1986) 

4. Beisenherz, G., et al.; Z. Naturf. 8b, 555-577 (1953) 

5. Thorne, C. J. R.; in: Techniques in Protein and Enzyme Biochemistry (Kornberg, H. L., et al. eds.), Pt. 1, B 104, 1-18, Elsevier-North Holland, Amsterdam (1978) 

Tải về tài liệu gốc tại đây

Tìm hiểu danh mục sản phẩm cho phương pháp đo quang phổ tại đây