XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIURET
Protein là các phân tử sinh học lớn và tham gia vào nhiều quá trình sinh lý trong sinh vật. Chúng bao gồm các chuỗi dài các axit amin được kết nối bởi các liên kết peptide. Định lượng protein là một lĩnh vực quan trọng trong phân tích sinh học. Có nhiều phương pháp khác nhau để định lượng nồng độ protein trong mẫu.
| Một trong những phương pháp phát hiện protein là phương pháp Biuret, dựa trên phản ứng giữa kim loại đồng với các liên kết peptide để tạo thành một phức hợp màu xanh tím. |
Trong bài viết này, chúng tôi sẽ giới thiệu phương pháp Biuret và quy trình thực hiện thí nghiệm dựa trên kỹ thuật đo quang phổ với thiết bị Spectroquant® Prove (phiên bản firmware 1.5 trở lên) và tất cả các thuốc thử cần thiết cho phép đo được bao gồm trong bộ dụng cụ thử nghiệm.
1. Tổng quan phương pháp BIURET
Protein tạo thành một phức hợp màu xanh tím trong dung dịch kiềm đồng sunfat có chứa tartrate (thuốc thử Biuret). Sự hấp thụ của hợp chất này sẽ đo được ở bước sóng 546 nm.
Khoảng đo:
– 0,5–5,0 g/l protein như albumin huyết thanh bò (phương pháp “Protein Biuret LR”, số 315)
– 1–10 g/l protein như albumin huyết thanh bò (phương pháp “Protein Biuret HR”, số 316)
Mẫu thử nghiệm: Mẫu dạng lỏng hoặc mẫu sau khi qua quá trình chuẩn bị thích hợp.
2. Thuốc thử và dụng cụ thử nghiệm BIURET
Cat.No. | Thông tin |
Thuốc thử | |
110307 | Bộ kit protein (Phương pháp Biuret) Tùy chọn, nếu bước kết tủa đã được thực hiện (đối với các mẫu màu và mẫu có nồng độ protein thấp) |
100807 | Trichloroacetic axit để phân tích EMSURE® ACS Tùy chọn, nếu hiệu chuẩn đã được thực hiện |
112018 | Albumin fraction V (từ huyết thanh bò) |
Thiết bị | |
Đối với phép đo protein, một trong những thiết bị đo quang phổ Spectroquant® sau đây là cần thiết | |
173018 | Spectroquant® UV/VIS Spectrophotometer Prove 600 |
173017 | Spectroquant® UV/VIS Spectrophotometer Prove 300 |
173016 | Spectroquant® UV/VIS Spectrophotometer Prove 100 |
Phần mềm bảo trì dữ liệu | |
Gói phần mềm Spectroquant® Prove Connect to LIMS cung cấp phương thức chuyển dữ liệu vào hệ thống LIMs một cách dễ dàng. Phần mềm này có thể đặt mua theo thông tin sau: | |
Y11086 | Prove Connect to LIMS |
Dụng cụ khác | |
C5291 | Cuvet chữ nhật 10 mm (polystyrene)* |
| Pipette với thể tích 0,5ml; 1,0ml and 2,0 ml |
* Tuyệt đối tránh sử dụng cuvet thạch anh; vì các chất nhuộm hấp phụ mạnh trên bề mặt này. Yêu cầu thực hiện đối với các mẫu đục: Lọc hoặc ly tâm | |
3. Quy trình thực hiện xác định protein bằng phương pháp BIURET
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch mẫu thí nghiệm cần ở trạng thái trong suốt. Nên thực hiện ly tâm hoặc lọc các mẫu đục trước khi thực hiện thí nghiệm.
– Đối với các mẫu màu và mẫu có hàm lượng protein thấp (< 0,5 g/l): protein nên được kết tủa từ một thể tích được xác định bằng dung dịch axit trichloroacetic và sau đó được hóa tan lại trong một thể tích (nhỏ hơn) của nước cất hoặc dung dịch đệm.
Chuẩn bị axit trichloroacetic (dung dịch TCA): Cẩn thận hòa tan 5 g axit trichloroacetic (Cat. No. 100807) trong 10 ml nước tinh khiết (50% (w /v).
Quy trình kết tủa: thêm 0,2 ml 50 % (w/v) dung dịch TCA cho mỗi 1 ml dung dịch mẫu, trộn và ly tâm. Loại bỏ dung dịch và hòa tan kết tủa trong một khối lượng nước cất nhỏ hơn.
Các mẫu có hàm lượng protein cao (>10g/l): mẫu cần được pha loãng với nước cất hoặc dung dịch đệm.
Lượng protein ước tính trong mẫu (g/l) |
|
<0,5 | Kết tủa TCA |
0,5 – 5,0 | Phương pháp “Protein Biuret LR”, số 315 |
1,0 – 10,0 | Phương pháp “Protein Biuret HR”, số 316 |
>10,0 | Pha loãng |
Chuẩn bị dung dịch đo lường
Quá trình chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng sẽ phụ thuộc vào phương pháp thực hiện. Cụ thể như sau:
| Khoảng đo 0,5 – 5,0 g/l | Khoảng đo 1,0 – 10,0 g/l | ||
| Mẫu đo | Mẫu trắng | Mẫu đo | Mẫu trắng |
Chuẩn bị mẫu | 0,5 ml | – | 1,0 ml | – |
Nước tinh khiết | – | 0,5 ml | – | 1,0 ml |
| . Hút mẫu vào ống nghiệm | |||
Dung dịch thuốc thử Biuret | 2,0 ml | 2,0 ml | 2,0 ml | 2,0 ml |
| . Trộn đều mẫu | |||
| . Để yên trong 30 phút. (thời gian phản ứng) ở nhiệt độ phòng, rót vào cuvet nhựa dùng một lần 10mm*, sau đó đo bằng Spectroquant® Prove spectrophotometer | |||
* Tuyệt đối tránh sử dụng cuvet thạch anh; các chất nhuộm hấp phụ mạnh trên bề mặt này. | ||||
Tiến hành đo mẫu
– Mở danh sách phương pháp () và chọn phương pháp số 315 “Protein Biuret LR” hoặc phương pháp số 316 “Protein Biuret HR”.
– Nên thực hiện đo Zero phương pháp mỗi ngày làm việc mới. Để làm điều này, hãy mở phương pháp, chọn và chọn <ZERO ADJUSTMENT> trên menu.